Abstract

A Cr:LiSrAlFl laser, pumped with a diffraction-limited laser diode and mode locked with a saturable Bragg reflector, produces 90-fs pulses at 860 nm with a cw power as high as 88 mW in two beams. It is shown that this recently developed, compact, solid-state laser can be used as an excitation source for two-photon laser scanning microscopy. Morphological and functional images of neocortical and cerebellar neurons were obtained with submicrometer three-dimensional resolution. Single dendritic spines could easily be resolved deep in scattering tissue.

© 1996 Optical Society of America

Full Article  |  PDF Article

References

  • View by:
  • |
  • |
  • |

  1. W. Denk, D. W. Piston, W. W. Webb, in Handbook of Biological Confocal Microscopy, J.B. Pawley, ed. (Plenum, New York, 1995) p. 445.
  2. R. Yuste, W. Denk, Nature (London) 375, 682 (1995).
    [CrossRef] [PubMed]
  3. W. Denk, M. Sugimori, R. Llinas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8279 (1995).
    [CrossRef] [PubMed]
  4. K. Svoboda, D. W. Tank, W. Denk, Science 272, 716 (1996).
    [CrossRef] [PubMed]
  5. W. Denk, J. R. Holt, G. M. G. Shepherd, D. P. Corey, Neuron 15, 1311 (1995).
    [CrossRef] [PubMed]
  6. W. Denk, K. R. Delanay, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D. W. Tank, R. Yuste, J. Neurosci. Methods 54, 151 (1994).
    [CrossRef] [PubMed]
  7. D. L. Wokosin, V. E. Centonze, J. G. White, S. N. Hird, S. Sepsenwol, G. P. A. Malcolm, G. T. Maker, A. S. Ferguson, Proc. SPIE 2678, 38 (1996).
    [CrossRef]
  8. U. Keller, D. A. B. Miller, G. D. Boyd, T. H. Chiu, J. F. Ferguson, M. T. Asom, Opt. Lett. 17, 505 (1992).
    [CrossRef] [PubMed]
  9. N. H. Rizvi, P. M. W. French, J. R. Taylor, P. J. Delfyett, L. T. Florez, Opt. Lett. 18, 983 (1993).
    [CrossRef] [PubMed]
  10. P. M. W. French, R. Mellish, J. R. Taylor, P. J. Delfyett, L. T. Florenz, Opt. Lett. 18, 1943 (1993).
    [CrossRef]
  11. D. Kopf, K. J. Weingarten, L. R. Brovelli, M. Kamp, U. Keller, Opt. Lett. 19, 2143 (1994).
    [CrossRef] [PubMed]
  12. S. Tsuda, W. H. Knox, E. A. de Souza, W. Y. Jan, J. E. Cunningham, Opt. Lett. 20, 1406 (1995).
    [CrossRef] [PubMed]
  13. C. Xu, W. W. Webb, J. Opt. Soc. Am. B 13, 481 (1996).
    [CrossRef]
  14. W. Denk, J. H. Strickler, W. W. Webb, Science 248, 73 (1990).
    [CrossRef] [PubMed]
  15. W. Denk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6629 (1994).
    [CrossRef] [PubMed]
  16. B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.
  17. O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, F. J. Sigworth, Pflueggers Arch. 391, 85 (1981).
    [CrossRef]

1996

K. Svoboda, D. W. Tank, W. Denk, Science 272, 716 (1996).
[CrossRef] [PubMed]

D. L. Wokosin, V. E. Centonze, J. G. White, S. N. Hird, S. Sepsenwol, G. P. A. Malcolm, G. T. Maker, A. S. Ferguson, Proc. SPIE 2678, 38 (1996).
[CrossRef]

C. Xu, W. W. Webb, J. Opt. Soc. Am. B 13, 481 (1996).
[CrossRef]

1995

S. Tsuda, W. H. Knox, E. A. de Souza, W. Y. Jan, J. E. Cunningham, Opt. Lett. 20, 1406 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, J. R. Holt, G. M. G. Shepherd, D. P. Corey, Neuron 15, 1311 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

R. Yuste, W. Denk, Nature (London) 375, 682 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, M. Sugimori, R. Llinas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8279 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

1994

W. Denk, K. R. Delanay, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D. W. Tank, R. Yuste, J. Neurosci. Methods 54, 151 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6629 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

D. Kopf, K. J. Weingarten, L. R. Brovelli, M. Kamp, U. Keller, Opt. Lett. 19, 2143 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

1993

1992

1990

W. Denk, J. H. Strickler, W. W. Webb, Science 248, 73 (1990).
[CrossRef] [PubMed]

1981

O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, F. J. Sigworth, Pflueggers Arch. 391, 85 (1981).
[CrossRef]

Alger, B. E.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Asom, M. T.

Boyd, G. D.

Brovelli, L. R.

Centonze, V. E.

D. L. Wokosin, V. E. Centonze, J. G. White, S. N. Hird, S. Sepsenwol, G. P. A. Malcolm, G. T. Maker, A. S. Ferguson, Proc. SPIE 2678, 38 (1996).
[CrossRef]

Chiu, T. H.

Corey, D. P.

W. Denk, J. R. Holt, G. M. G. Shepherd, D. P. Corey, Neuron 15, 1311 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

Cunningham, J. E.

de Souza, E. A.

Delanay, K. R.

W. Denk, K. R. Delanay, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D. W. Tank, R. Yuste, J. Neurosci. Methods 54, 151 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

Delfyett, P. J.

Denk, W.

K. Svoboda, D. W. Tank, W. Denk, Science 272, 716 (1996).
[CrossRef] [PubMed]

R. Yuste, W. Denk, Nature (London) 375, 682 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, J. R. Holt, G. M. G. Shepherd, D. P. Corey, Neuron 15, 1311 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, M. Sugimori, R. Llinas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8279 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, K. R. Delanay, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D. W. Tank, R. Yuste, J. Neurosci. Methods 54, 151 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6629 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, J. H. Strickler, W. W. Webb, Science 248, 73 (1990).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, D. W. Piston, W. W. Webb, in Handbook of Biological Confocal Microscopy, J.B. Pawley, ed. (Plenum, New York, 1995) p. 445.

Dhanjal, S. S.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Dingleding, R.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Ferguson, A. S.

D. L. Wokosin, V. E. Centonze, J. G. White, S. N. Hird, S. Sepsenwol, G. P. A. Malcolm, G. T. Maker, A. S. Ferguson, Proc. SPIE 2678, 38 (1996).
[CrossRef]

Ferguson, J. F.

Florenz, L. T.

Florez, L. T.

French, P. M. W.

Garthwaite, J.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Gelperin, A.

W. Denk, K. R. Delanay, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D. W. Tank, R. Yuste, J. Neurosci. Methods 54, 151 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

Hamill, O. P.

O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, F. J. Sigworth, Pflueggers Arch. 391, 85 (1981).
[CrossRef]

Herderson, G.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Hird, S. N.

D. L. Wokosin, V. E. Centonze, J. G. White, S. N. Hird, S. Sepsenwol, G. P. A. Malcolm, G. T. Maker, A. S. Ferguson, Proc. SPIE 2678, 38 (1996).
[CrossRef]

Holt, J. R.

W. Denk, J. R. Holt, G. M. G. Shepherd, D. P. Corey, Neuron 15, 1311 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

Jan, W. Y.

Kamp, M.

Keller, U.

King, G. L.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Kleinfeld, D.

W. Denk, K. R. Delanay, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D. W. Tank, R. Yuste, J. Neurosci. Methods 54, 151 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

Knox, W. H.

Kopf, D.

Lipton, P.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Llinas, R.

W. Denk, M. Sugimori, R. Llinas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8279 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

Maker, G. T.

D. L. Wokosin, V. E. Centonze, J. G. White, S. N. Hird, S. Sepsenwol, G. P. A. Malcolm, G. T. Maker, A. S. Ferguson, Proc. SPIE 2678, 38 (1996).
[CrossRef]

Malcolm, G. P. A.

D. L. Wokosin, V. E. Centonze, J. G. White, S. N. Hird, S. Sepsenwol, G. P. A. Malcolm, G. T. Maker, A. S. Ferguson, Proc. SPIE 2678, 38 (1996).
[CrossRef]

Marty, A.

O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, F. J. Sigworth, Pflueggers Arch. 391, 85 (1981).
[CrossRef]

Mellish, R.

Miller, D. A. B.

Neher, E.

O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, F. J. Sigworth, Pflueggers Arch. 391, 85 (1981).
[CrossRef]

North, A.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Piston, D. W.

W. Denk, D. W. Piston, W. W. Webb, in Handbook of Biological Confocal Microscopy, J.B. Pawley, ed. (Plenum, New York, 1995) p. 445.

Rizvi, N. H.

Sakmann, B.

O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, F. J. Sigworth, Pflueggers Arch. 391, 85 (1981).
[CrossRef]

Schwartzkroin, P. A.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Sears, T. A.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Segal, M.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Sepsenwol, S.

D. L. Wokosin, V. E. Centonze, J. G. White, S. N. Hird, S. Sepsenwol, G. P. A. Malcolm, G. T. Maker, A. S. Ferguson, Proc. SPIE 2678, 38 (1996).
[CrossRef]

Shepherd, G. M. G.

W. Denk, J. R. Holt, G. M. G. Shepherd, D. P. Corey, Neuron 15, 1311 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

Sigworth, F. J.

O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, F. J. Sigworth, Pflueggers Arch. 391, 85 (1981).
[CrossRef]

Strickler, J. H.

W. Denk, J. H. Strickler, W. W. Webb, Science 248, 73 (1990).
[CrossRef] [PubMed]

Strowbridge, B. W.

W. Denk, K. R. Delanay, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D. W. Tank, R. Yuste, J. Neurosci. Methods 54, 151 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

Sugimori, M.

W. Denk, M. Sugimori, R. Llinas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8279 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

Svoboda, K.

K. Svoboda, D. W. Tank, W. Denk, Science 272, 716 (1996).
[CrossRef] [PubMed]

Tank, D. W.

K. Svoboda, D. W. Tank, W. Denk, Science 272, 716 (1996).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, K. R. Delanay, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D. W. Tank, R. Yuste, J. Neurosci. Methods 54, 151 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

Taylor, J. R.

Tsuda, S.

Webb, W. W.

C. Xu, W. W. Webb, J. Opt. Soc. Am. B 13, 481 (1996).
[CrossRef]

W. Denk, J. H. Strickler, W. W. Webb, Science 248, 73 (1990).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, D. W. Piston, W. W. Webb, in Handbook of Biological Confocal Microscopy, J.B. Pawley, ed. (Plenum, New York, 1995) p. 445.

Weingarten, K. J.

White, J. G.

D. L. Wokosin, V. E. Centonze, J. G. White, S. N. Hird, S. Sepsenwol, G. P. A. Malcolm, G. T. Maker, A. S. Ferguson, Proc. SPIE 2678, 38 (1996).
[CrossRef]

Whittingham, T. S.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Williams, J.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Wokosin, D. L.

D. L. Wokosin, V. E. Centonze, J. G. White, S. N. Hird, S. Sepsenwol, G. P. A. Malcolm, G. T. Maker, A. S. Ferguson, Proc. SPIE 2678, 38 (1996).
[CrossRef]

Xu, C.

Yuste, R.

R. Yuste, W. Denk, Nature (London) 375, 682 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, K. R. Delanay, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D. W. Tank, R. Yuste, J. Neurosci. Methods 54, 151 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

J. Neurosci. Methods

W. Denk, K. R. Delanay, A. Gelperin, D. Kleinfeld, B. W. Strowbridge, D. W. Tank, R. Yuste, J. Neurosci. Methods 54, 151 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

J. Opt. Soc. Am. B

Nature

R. Yuste, W. Denk, Nature (London) 375, 682 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

Neuron

W. Denk, J. R. Holt, G. M. G. Shepherd, D. P. Corey, Neuron 15, 1311 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

Opt. Lett.

Pflueggers Arch.

O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, F. J. Sigworth, Pflueggers Arch. 391, 85 (1981).
[CrossRef]

Proc. Natl. Acad. Sci. USA

W. Denk, M. Sugimori, R. Llinas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 8279 (1995).
[CrossRef] [PubMed]

W. Denk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6629 (1994).
[CrossRef] [PubMed]

Proc. SPIE

D. L. Wokosin, V. E. Centonze, J. G. White, S. N. Hird, S. Sepsenwol, G. P. A. Malcolm, G. T. Maker, A. S. Ferguson, Proc. SPIE 2678, 38 (1996).
[CrossRef]

Science

W. Denk, J. H. Strickler, W. W. Webb, Science 248, 73 (1990).
[CrossRef] [PubMed]

K. Svoboda, D. W. Tank, W. Denk, Science 272, 716 (1996).
[CrossRef] [PubMed]

Other

W. Denk, D. W. Piston, W. W. Webb, in Handbook of Biological Confocal Microscopy, J.B. Pawley, ed. (Plenum, New York, 1995) p. 445.

B. E. Alger, S. S. Dhanjal, R. Dingleding, J. Garthwaite, G. Herderson, G. L. King, P. Lipton, A. North, P. A. Schwartzkroin, T. A. Sears, M. Segal, T. S. Whittingham, J. Williams, in Brain Slices, R. Dingledine, ed. (Plenum, New York, 1984), p. 381.

Cited By

OSA participates in CrossRef's Cited-By Linking service. Citing articles from OSA journals and other participating publishers are listed here.

Alert me when this article is cited.


Figures (4)

Fig. 1
Fig. 1

Schematic of the laser scanning microscope with a diode-pumped Cr:LiSrAlFl laser as the excitation source. Intracavity prisms provide dispersion compensation. PMT, photomultiplier tube.

Fig. 2
Fig. 2

Two-photon fluorescence excitation scanning image of living cerebellar Purkinje cell in a brain slice. A, Low-magnification image. Note the prominent dendritic arbor (to the right) and the axon's initial segment (left, arrow). B, Higher-magnification image of part of the dendritic arbor. Note clearly resolved dendritic spines. Images are maximum value projections of A, 173 and B, 91 sections acquired with 0.8- and 0.6-μm focal-plane spacing, respectively. The pixel dimensions are A, 0.27 μm × 0.27 μm and B, 0.081 μm × 0.081 μm. The dwell time per pixel was 7.8 μs. Each section is the average of 10 scans. C, Four consecutive sections from the boxed region of B, spaced 1.8 μm apart.

Fig. 3
Fig. 3

Changes of two-photon-excited fluorescence (ΔF) in the apical dendrite of a pyramidal cell reflecting [Ca2+]i changes evoked by single-action potentials (solid arrow). Schematic of the experimental arrangement (right). Data were acquired by repeated scanning of a single line (location indicated by the dashed arrow, right) across the dendrite at 2-ms intervals while single-action potentials were evoked 300 ms after initiation of data acquisition (solid arrow). The action potential retrogradely invades the dendrite. Data were averaged over the spatial dimension and plotted against time. A, Single response; B, averaged ten times.

Fig. 4
Fig. 4

TPLSM imaging of a neocortical brain slice stained with the voltage-sensitive membrane dye, di-4-ANEPPS, 60 μm below the surface of the slice. The pixel dimension is 0.32 mm × 0.32 mm, the dwell time per pixel is 2.6 ms per scan, and the image is the average of 10 scans. Note the prominent apical dendrites of the pyramidal cells.

Metrics